طرق فصل بروتينات بلازما الدم

جامعة بابل/ كلية التربية الاساسية
قسم العلوم/ فرع الكيمياء
المحاضرة السابعة- رقم القاعة (3)
اسم التدريسي ودرجته العلمية- انتصار رحيم عبيد- مدرس مساعد
طرق فصل بروتينات بلازما الدم:
البروتينات: مركبات عضوية معقدة التركيب ذات وزن جزيئي عالٍ تتركب من الاحماض الامينية تتواجد في تركيب كل المخلوقات الحية والفايروسات وهي الحجر الأساس في بناء الخلية وإدامة هيكلها , بالإضافة الى كونها واسطات وظائف الخلية فالعديد من البروتينات تشكل الإنزيمات أو قد تدخل وحدات بروتينية في تركيب بعض الإنزيمات وتضم الخلية ألافا من جزيئات البروتينات المختلفة في خواصها الحياتية و الكيميائية و الفيزيائية.
يتم فصل البروتينات من مصادرها ايا كانت لإغراض شتى مثل:-
1- تنقيتها وفصلها كل على انفراد لغرض تشخيصها وتقدير كميتها.
2- دراسة الخواص البايلوجية والكيميائية والفيزيائية للبروتينات لغرض استنباط علاقة التركيب بالوظيفة
3-مقارنة البروتينات المستخلصة من نماذج مختلفة لغرض استنتاج علاقات مفيدة في الاغراض الدراسية المقارنة.
4- استخلاصها للإغراض التجارية حيث تدخل في العديد من الصناعات الدوائية والغذائية.

طرق فصل بروتينات بلازما الدم:
1- تركيد البروتينات
ا- التمليح الخارجي والداخلي للبروتينات salting in &salting out of proteins
عند اضافة محلول متعادل من كلوريد الصديوم او كبريتات المغنسيوم او كبريتات الامونيوم تتركد البروتينات معتمدة على نوعية وتركيز هذه الاملاح .ان سبب حدوث التركيد يعود الى تعادل شحنات جزيئات البروتين بواسطة الشحنات التي تحملها ايونات الاملاح ونتيجة لهذا التعامل فانها تتجمع وتنفصل وتسمى هذه الظاهرة بالتلميح الخارجي اما التراكيز القليلة من الاملاح المتعادلة فقد تزيد من ذوبان البروتينات في المحلول وتسمى حينئذ بالتمليح الداخلي (salting in) تتركد البروتينات وهي بحالتها الطبيعة بالاملاح المتعادلة ويمكن اعادة اذابتها حيث ان التركيد عكسي-بدون ان يطرأ اي تغيير على طبيعة تركيب الاحماض الامينية.
ب- التركيد بواسطة المعادن الثقيلة
تتم عملية التركيد بواسطة تكون معقدات تربط البروتينات بايونات المعادن الثقيلة وتستعمل كطريقة لفصل البروتينات باستعمال هذه الايونات مثل الزئبق Hg++ ,الكادميوم Cd++,Zn++.
ج- تركيد البروتينات بواسطة الاحماض المركزة
يستعمل حامض النتريك المركز بتركيد البروتينات ويعتبر احد الكواشف المهمة والذي يستعمل للكشف عن الزلال بالبول ويحدث التركيد بنوعيه العكسي وغيره.
د- تركيد البروتينات بواسطة الاحماض المعقدة والقلويات
يستعمل حامض التنكستيك لتركيد البروتينات وكذلك يمكن ان يقوم حامض الفوسفوتنكستيك بالعمل نفسه ,كما يمكن استعمال الاحماض التي يطلق عليها اسم مرسبات القلويات بالعمل نفسه
طرائق فصل البروتينات التي تعتمد عللا الاختلاف في الاذابة :
تتأثر اذابة البروتينات في المحاليل بصورة كبيرة ب:
1- درجة الاس الهيدروجيني
2- القوة الايونية
3- ثابت العزل الحراري للمذيبات
4- درجة الحرارة
وهذه المتغيرات –تعكس حقيقة كون البروتينات الكترولايت (الشوارد) ذات اوزان جزيئية عالية وتستعمل لغرض خليط منها.

استخلاص وتنقية البروتينات isolation and purification of protien
ان تعدد البروتينات ونشاطاتها الحياتية والاختلافات الكيميائية بينها جعلت عملية الاستخلاص والتنقية وتحديد الصفات البروتينية من اساسيات الكيمياء الحياتية, فقد تم تنقية عدد كبير من البروتينات بهيئة بلورات وبأشكال مختلفة ومن المتطلبات الرئيسية في عمليات التنقية تحرير البروتينات من الخلية بدون تلف نشاطها بطرق المزج الميكانيكي وتجانس الانسجة الحيوانية والتي تستعمل لتكسير جدران الخلايا وتحرير مكوناتها ,كما ان هناك طرقا اخرى تستعمل الصوتية والطحن بالرمل او التجزئة بالضغط العالي.
فان وجد البروتين في احد اجزاء الخلية ,يمكن استعمال الاخير كمواد اولية لتنقيته بصورة اكبر ,وبعد الحصول على البروتين بشكل ذائب يمكن حينئذ عزل البروتينات الاخرى بالطرق مثل بؤرة تعادل الشحنة (التبئر الكربائي ,التجزئة بالتملح الخارجي ,الترسيب بالمذيب ,كروكوتوغرافيا الطرد الجزيئي , كروموتوغرافيا التبادل الايوني وغيرها.
يمكن الكشف عن نقاوة البروتينات بالطرق التالية:
1- قابلية الذوبان : لكل نوع من البروتينات قابلية ذوبان متميزة في مذيب معين يمكن عن طريقها استخلاص البروتين المناسب.
2- الترحيل الكهربائي
3- طرق الفصل الكروموتوغرافي
4- الكشف عن المكونات الموجودة في البروتينات مثل المعادن وغيرها.
5- الطرق المناعية
6- استعمال اجهزة النبذ المركزي عالية السرعة

طرق فصل البروتينات التي تعتمد على حجمها الجزيئي:
1- الفرز الغشائي dialysis
يمكن فصل البروتينات الكروية من المذاب ذي الاوزان الجزيئية الواطئة بطريقة الفرز , ويعتمد ذلك على استعمال الغشاء نصف النفاذ الذي يسمح للمذاب صفير الوزن الجزيئي بالنفاد ويمنع البروتينات من القيام بذلك حسب الشكل التالي:


2- التركيد الموقعي ذو التدرج بالكثافة
نظرا لقابلية البروتينات في المحاليل لان تتركد بسرعة عالية مقاومة للانتشار (diffusion) فمن الممكن فصل خليط بروتيني بطريقة النبذ وبالاخص ذي التسلسل الكثافي الموقعي .وتتم العملية حسب الاشكال التالية وبذلك بوضع تسلسل كثافي من السكروز في انبوبة بلاستيكية يخلط فيها محلول السكروز المركز مع الماء بنسب تنازلية الى اعلى الانبوبة. بعد ذلك يضاف الخليط البروتيني بطبقات على قمة الانبوبة .وتتم عملية النبذ الافقي في الدوار بسرعة عالية ويمكن بذلك تحديد مواقع الحزم البروتينية بصورة ضوئية .او ازالة محتويات الانبوبة بصورة دقيقة بواسطة ثقب في قعر الانبوبة كما في الشكل الاتي :


ج- كروموتوغرافيا الطرد الجزيئي:
ويسمى ايضا الترشيح الهلامي او كروموتوغرافيا الغربال الجزيئي. وتستعمل في هذه الطريقة مواد السيفادكس وهي مشتقات سكرية متعددة او البايوجل bio-gol وهي مشتقات اكاروز السكرية المتعددة ,وتحضر هذه جميعا بدرجات مختلفة من المسامية. ونظرا لاستعمال البروتينات باوزان جزيئية مختلفة فان بعضها تدخل في المسامات الداخلية بدرجات مختلفة لذا فهي تتحرك في العمود بسرع مختلفة كما في الشكل الاتي

فالبروتينات ذات الاوزان الجزيئية العالية لا تدخل في المسامات ,فتطرد خارجها ,بينما البروتينات الصغيرة تدخل في المسامات بصورة حرة وتمنع من الخروج بسرعة ,اما البروتينات ذات الاوزان الجزيئية المتوسطة فتطرد من المسامات برجات محدودة.


طرق الفصل التي تعتمد على الشحنة الكهربائية:
تعود طرق فصل البروتينات التي تعتمد على الشحنة الكهربائية الى صفاتها القاعدية والحامضية لوجود عدد من المجاميع الايونية في السلاسل الببتيدية . ونظرا لاختلاف البروتينات في تركيب وترتيب الاحماض الامينية فيها, ينتج عن ذلك صفات قاعدية حامضية متميزة لكل منها. منحني التسحيح للبروتين الرايبونكلييز الذي يحتوي على 124 حامضا اميناً ويمتلك 34 منها مجاميع متاينة R اضافة الى النهايتين الكربونية والنتروجينية والتي تمثل المجاميع الايونية المختلفة لها. ويوضح المساهمة التقريبية لكل مجموعة ايونية وكذلك قيم التفكك الايوني PK لمختلف هذه المجاميع ويتضح انها تختلف عن نفس المجاميع الموجودة في الاحماض الامينية الحرة بسبب تأتيرات الشحنات المجاورة.